翻译：徐丽a；徐胜坤a；审校：史钟b
a中国科医院-温州医科大学联合培养硕士研究生；b中国科医院结直肠内科
引用此文：HannahNBell,etal.Reuterininthehealthygutmicrobiomesuppressescolorectalcancergrowththroughalteringredoxbalance.CancerCell.Feb14;40(2):-.e6.doi:10./j.ccell..12..
简介
结肠癌的微生物组发生了显著的变化，从而促进了肿瘤的生长。贝尔等人发现抗肿瘤细菌罗伊氏乳杆菌在结肠癌中减少。罗伊氏菌素通过诱导氧化应激和抑制蛋白质翻译来抑制结直肠癌。用罗伊氏乳杆菌重新定植可在多个结肠肿瘤模型中提高存活率。
研究亮点
来自健康结肠的微生物代谢物抑制结肠肿瘤的发生。
在小鼠和人类结肠癌中罗伊氏乳杆菌和罗伊氏菌素水平降低。
罗伊氏菌素诱导蛋白质氧化并抑制核糖体生物合成。
罗伊氏乳杆菌和罗伊氏菌素可降低小鼠肿瘤生长并延长生存期。
摘要
微生物生态失调是结直肠癌(CRC)的一个标志，可以促进炎症、肿瘤生长和治疗反应。肠道微生物通过代谢物发出信号，但代谢物如何影响CRC在很大程度上还不清楚。我们分析了不同突变负荷的结肠肿瘤发生的小鼠模型中的相关粪便代谢物。我们发现来自健康小鼠或人类的肠道菌群代谢物对结直肠癌具有生长抑制作用，而来自肠癌小鼠或人类结直肠癌患者的肠道菌群代谢物对结直肠癌细胞的抑制作用则减弱。微生物谱显示结直肠癌疾病模型小鼠或结直肠癌患者的肠道菌群中罗伊氏乳杆菌及其代谢物罗伊氏菌素的水平较正常有下调。罗伊氏菌素能诱导选择性的蛋白质氧化并抑制核糖体生物合成和蛋白质翻译。外源罗伊氏乳杆菌能抑制结肠肿瘤生长，增加肿瘤活性氧，减少体内蛋白质翻译。我们的研究结果表明，健康的微生物组，特别是罗伊氏乳杆菌，通过微生物代谢物交换对结直肠癌起到预防作用。
介绍
结直肠癌（CRC）是第三大常见癌症，也是癌症死亡的第四大常见原因。除了一部分患者是由于遗传突变外，生活方式、饮食、炎症和微生物组的改变也会共同影响结直肠癌的发生和发展。如果没有区域或远处转移，结直肠癌患者的预后较好。然而，对转移性疾病的患者缺乏有效的治疗方法，而且大多数肠癌患者对免疫治疗没有反应。
大肠癌患者肠道微生物群的改变是很常见的。无菌或广谱抗生素的小鼠模型已被用来理解共生细菌群落在结直肠癌中的作用。从这些研究中获得的数据并不一致，可能是由于所采用的模型不同以及不同菌落间肠道微生物群的差异所致。然而，这些研究中的绝大多数都表明共生菌促进肿瘤的发生。无菌小鼠在结肠炎相关的结肠癌模型中促进了结肠癌的发生。总体而言，这些数据表明，微生物种类可以促进或抑制结肠肿瘤的生长，这取决于具体环境。一些证明微生物-上皮之间的相互作用能保持肠道屏障功能，维持新陈代谢，并调节系统和粘膜免疫反应的研究也进一步突出了肠道菌群在结肠肿瘤发生中的复杂作用。大肠癌进展过程中的常驻微生物群落的紊乱可能导致病理性的生物失调，从而促进肿瘤的生长和存活。最近的宏基因组学研究发现，息肉样腺瘤和粘膜内癌患者的微生物区系具有阶段特异性的变化。肿瘤微生物区系富含致病细菌梭杆菌、脆弱类杆菌和普雷沃特氏菌。最近的研究对病原菌促进肿瘤生长和存活的机制有了更深入的认识，例如通过诱导炎症、产生生物膜和分泌基因*素等机制。然而，有关特定宿主微生物抗肿瘤特性的研究报道甚少。
共生微生物利用宿主和饮食因素，通过细胞自主生物合成途径产生代谢物。研究最多的共生微生物因子是短链脂肪酸(SCFA)，如丁酸盐，能抑制正常肠道干细胞和一系列癌症细胞系的生长。微生物区系、肿瘤上皮和基质细胞之间的异细胞代谢相互作用是一个新兴的概念，目前还不清楚微生物群是如何通过代谢产物交换改变肿瘤生长的。在这项工作中，我们发现来自健康人类和小鼠的粪便代谢物有效地抑制了结肠癌的生长。具有较高突变负荷的小鼠结肠癌小鼠模型与大肠癌中促进生长的生物失调和微生物代谢产物有关。我们发现了一种共生微生物菌种--罗伊氏乳杆菌及其代谢物罗伊氏菌素，它能有效地减缓结肠癌的进展。我们发现野生型小鼠的微生物群改变了结肠癌细胞的氧化还原状态，并抑制了核糖体的生物发生。综上所述，我们的发现证明了健康的微生物组，特别是罗伊氏乳杆菌，是治疗大肠癌的一种潜在的有益的方法。
结果
健康小鼠粪便代谢物抑制CRC细胞的生长
为了探讨微生物代谢产物在CRC发生中的潜在作用，我们使用了结肠肿瘤发生的基因工程小鼠模型。我们使用他莫昔芬调节的CDX2p-CreERT2转基因靶向鼠Apc等位基因的两个拷贝，这导致了远端结肠和直肠非侵袭性腺瘤的发生。我们生成了DoubleMut双突变(其中Apc和Trp53等位基因在结肠上皮中同时失活)，以及将APC/p53敲除与KrasG12D敲入等位基因相结合的TripleMut三突变小鼠模型(图1A)。使用他莫昔芬单次治疗引发肿瘤发生的10天后，分离小鼠粪便微生物代谢产物并用于治疗HCT、SW、DLD1和RKO结直肠癌细胞系(图1B)。野生型小鼠的粪便代谢产物对CRC细胞系增殖有很强的抑制作用。从SingleMut和DoubleMut中分离出的粪便代谢产物在较低程度上降低了增殖，而从TripleMut小鼠模型中分离出的代谢产物不具有生长抑制作用。野生型小鼠的粪便代谢产物导致所有四种细胞系中的细胞死亡和集落形成减少(图1C，1D)。同样，正常人粪便代谢产物(而非从疾病活动的CRC患者中分离出的代谢产物)会抑制CRC细胞系的生长(图1E)。微生物代谢产物不会抑制非癌性人类肠道细胞系NCM(图1E)。这种以粪便代谢物为基础的CRC细胞系的抑制源于微生物(图1F)。
非靶向代谢组学确定了野生型小鼠体内最丰富的微生物代谢物。从微生物衍生的代谢物中专门产生了一个小分子文库(图1G)。根据细胞增殖情况筛选出最丰富的50种代谢物。我们把重点放在抑制作用最强的化合物上。通过在第二细胞系中进行二次生长筛选，鉴定出了1，3二氨基丙烷和罗伊氏菌素，这两种物质在正常结肠中都有很高的丰度(图1H)。酪胺和盐酸吡哆醇对大肠癌生长的抑制作用相对较小(图1H)。第一次筛选使用1mM单次剂量，第二次筛查使用um的剂量。罗伊氏菌素被确认为抑制作用最强的化合物。
罗伊氏菌素在人类和小鼠结肠癌中的活性降低
我们对野生型(CRE-)、DoubleMut和TripleMut小鼠的粪便进行了16srRNA测序，以确定随着肿瘤的进展微生物群落是如何改变的。DoubleMut和TripleMut在早期时间点具有相似的增殖指数和异型增生指数。未诱导小鼠或笼-特异性分层之间的微生物组没有差异。主坐标分析(PCoA)通过分子方差分析(AMOVA)证实CRE（-）的小鼠、DoubleMut和TripleMut均具有明显不同的微生物组，并且分别在两个PCoA轴上聚集（图2A）。有趣的是，PCoA图将乳酸杆菌确定为导致组间差异的主要驱动因素（图2B）。紧随其后的是Lachnospiracaea和Muribaculaceae，它们都与炎症和结肠癌风险的改变有关。
我们在微生物代谢物生长筛选中识别出了罗伊氏菌素或3-羟基丙醛。罗伊氏菌素主要作为抗菌素被研究。罗伊氏菌素主要由罗伊氏乳杆菌产生，它是人体肠道的天然定植菌，是甘油代谢为1,3-丙二醇的中间体。在DoubleMut和TripleMut粪便样本的16S-seq样本中，罗伊氏乳杆菌显著减少（图2C）。在诱导的DoubleMut和TripleMut小鼠模型中，乳酸杆菌属呈下降趋势。其他乳杆菌属物种，如嗜酸乳杆菌，也被下调。发现罗伊氏乳杆菌在另外一个独立的TripleMut小鼠队列中显著降低。我们接下来对肿瘤粘膜样本进行了16SrRNA测序。乳酸杆菌属不是肿瘤中PCoA载体的主要贡献者。然而，罗伊氏乳杆菌在TripleMut肿瘤黏膜中明显减少（图2D)。评估的其他乳杆菌没有在肿瘤微生物组中显著减少。这表明尽管乳酸菌作为一个属可能在粪便中全面下调，罗伊氏乳杆菌在肿瘤黏膜中特异性下调。
我们首先挖掘了公开可用的数据库，以评估罗伊氏乳杆菌在CRC和正常人类微生物组之间的变化。在对八项结肠肠道微生物组研究的荟萃分析中，乳酸菌在早期和晚期CRC中均显著减少。肠腔内容物和肿瘤切片的测序显示癌症中的乳酸杆菌减少。最后，对早期和侵袭性结直肠癌进行16SrRNA测序发现，与早期癌症相比，侵袭性癌症的乳酸杆菌含量较低。接下来，我们深入研究了一小群具有相邻正常组织的CRC组织样本，以量化罗伊氏乳杆菌（L.reuteri）（图2E)。我们看到肿瘤样本中罗伊氏乳杆菌的水平显著降低。接下来，我们使用了来自年龄匹配的健康对照和不同分期CRC的更大的患者组织样本队列。在这个独立队列中，与健康对照组相比，罗伊氏乳杆菌在CRC的所有分期均显著减少（图2F)。
我们还使用基于炎症的致癌模型AOM-DSS来诱导肿瘤。与正常组织相比，肿瘤组织中的罗伊氏乳杆菌减少，表明结肠肿瘤中罗伊氏乳杆菌的减少是保守的。与肿瘤组织中罗伊氏乳杆菌的减少相一致，在散发性和AOM-DSS结肠肿瘤小鼠模型中，罗伊氏乳杆菌的含量呈递减趋势。（图2G)。与邻近的正常组织相比，人类肿瘤组织中的罗伊氏菌素水平也降低了（图2H）。这表明癌性上皮会局部影响罗伊氏乳杆菌，从而影响罗伊氏菌素的水平。二氨基丙烷没有改变，证明罗伊氏菌素的减少是特异性的。
有趣的是，TripleMut小鼠粪便代谢物在体外强烈抑制了罗伊氏乳杆菌的生长（图2I和2J）。相比之下，CRENEG提取物抑制CRC细胞的生长，但对罗伊氏乳杆菌生长的影响明显较小。这种效应不太可能仅仅是肿瘤负荷的结果，因为小鼠的结肠癌变的百分比相同。我们证实TripleMut粪便提取物对大肠杆菌或一种粪便细菌复合物都没有抑制作用。我们试图确定抑制性化合物的潜在来源是微生物还是上皮细胞。在他莫昔芬诱导前，我们用广谱抗生素混合物治疗TripleMut小鼠1周。我们在诱导时停止使用抗生素，并在第10天产生粪便提取物。我们观察到对罗伊氏乳杆菌的生长抑制是持续的（图2?）。此外，我们的数据表明，TripleMut小鼠对罗伊氏乳杆菌的生长抑制是代谢物衍生的，因为该化合物在加热后仍然具有生长抑制作用（图2L)。我们研究了来自CRC细胞系的条件培养基是否抑制罗伊氏乳杆菌（图2M）。SW、HCT和RKO的条件培养基均能抑制罗伊氏乳杆菌的生长。煮沸培养基并没有改变生长抑制功能，这表明抑制因子是一种代谢物。我们在小鼠CRC细胞系CT26中开发了KRAS的shRNA敲降。降低KRAS并不能逆转对罗伊氏乳杆菌的抑制作用。
在DoubleMut、TripleMut和CRE（-）小鼠模型上进行了靶向代谢组学；2D无监督聚类显示小鼠模型之间存在明显差异（图2N)。我们